沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的疑似菌落一定是沙門(mén)氏菌么？不一定哦。本文中所探討的弗氏檸檬酸菌桿菌（Citrobacter freundii）就是一種常見(jiàn)的干擾菌，由于其與沙門(mén)氏菌在生理生化上具有很多相似的特性，如氧化酶、脂肪酶、苯丙氨酸脫氫酶測(cè)試都呈陰性，多數(shù)菌株能利用檸檬酸鹽，可以利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S（造成沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基假陽(yáng)性的主要原因）等，可能使得檢測(cè)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生誤判，因此《藥典》也強(qiáng)調(diào)仍需對(duì)疑似菌落進(jìn)行適宜的鑒定。本文對(duì)檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和沙門(mén)屬菌屬（Salmonella）的生理生化特性上的異同進(jìn)行了比較，同時(shí)也從基因組水平上分析這兩類(lèi)菌產(chǎn)生相似理化現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)，有耐心的看官就請(qǐng)繼續(xù)往下看吧。

研究背景

沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)是腸桿菌科中一種重要的人畜致病菌，部分菌株可引起胃腸炎、傷寒、副傷寒、敗血癥等疾病。2015版《中國(guó)藥典》明確將其作為控制菌進(jìn)行檢查。

藥典對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)主要分為三步：①供試液制備和增菌培養(yǎng)；②選擇和分離培養(yǎng)；③結(jié)果判定。主要利用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的增菌，木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的篩菌及顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌。但往往在沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)雜菌干擾。因此，藥典也強(qiáng)調(diào)，在最后三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)沙門(mén)氏菌的疑似菌落時(shí)，仍需進(jìn)一步做適宜的鑒定試驗(yàn)。

沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)中出現(xiàn)干擾菌的主要原因?yàn)楦蓴_菌有許多生理生化特性和沙門(mén)氏菌相似，可利用葡萄糖并且產(chǎn)生酸，還可通過(guò)代謝培養(yǎng)基中的硫代硫酸鹽產(chǎn)生硫化氫，能與培養(yǎng)基中鐵鹽反應(yīng)生成黑色硫化鐵。近期，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有株菌能夠在沙門(mén)氏選擇性培養(yǎng)基中出現(xiàn)疑似沙門(mén)氏菌的理化特性，但是通過(guò)進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)是一株弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）。查閱第二版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌屬和沙門(mén)氏菌屬有許多相似之處，這也說(shuō)明了為何檸檬酸桿菌屬會(huì)成為一種常見(jiàn)沙門(mén)氏選擇性培養(yǎng)基的干擾菌。

本文將從基因組水平上分析兩類(lèi)菌為何會(huì)出現(xiàn)相似的理化反應(yīng)，探討調(diào)控H2S產(chǎn)生基因（PHS基因）的結(jié)構(gòu)，揭示了部分檸檬酸桿菌屬為何會(huì)在沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基出現(xiàn)和沙門(mén)氏菌相似理化現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)，這對(duì)了解和鑒定兩類(lèi)菌具有重要指導(dǎo)意義。

沙門(mén)氏菌屬（Salmonella）

沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)是腸桿菌科中一個(gè)重要成員，在1885年，由美國(guó)獸醫(yī)師丹尼爾?E?沙門(mén)首次分離得到，主要寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)，是一類(lèi)重要致病菌。大多數(shù)沙門(mén)氏菌對(duì)人和動(dòng)物都有致病性，是目前引起人類(lèi)食物中毒的一種重要致病菌，在食品、藥品、公共衛(wèi)生領(lǐng)域都給予了極大重視。根據(jù)第二部《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》介紹，沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)，革蘭氏陰性桿菌，周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，可利用D -葡萄糖產(chǎn)生氣體。多數(shù)沙門(mén)氏菌都能產(chǎn)生硫化氫，但也有少數(shù)血清型的不能產(chǎn)生硫化氫，吲哚實(shí)驗(yàn)一般呈陰性，可將檸檬酸鹽作為唯一碳源，通常賴(lài)氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的反應(yīng)呈陽(yáng)性，脲酶陰性，一般不能發(fā)酵蔗糖、水楊酸、肌醇和杏仁苷，不產(chǎn)生脂肪酶和脫氧核糖核酸酶，具有致病性，可引起胃腸炎、傷寒、副傷寒、敗血癥等疾病。

常見(jiàn)沙門(mén)氏菌種有腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis)和邦戈?duì)柹抽T(mén)氏菌(Salmonella bongori)，其中腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis)又分為6個(gè)亞種，分別是腸沙門(mén)氏菌腸亞種(Salmonella enteritidissubsp.enterica)、腸沙門(mén)氏菌薩拉姆亞種(Salmonella enteritidis subsp. salamae)、腸沙門(mén)氏菌亞利桑那亞種(Salmonella enteritidis subsp. arizonae)、腸沙門(mén)氏菌印度亞種(Salmonella enteritidis subsp. indica)、腸沙門(mén)氏菌豪頓亞種(Salmonella enteritidis subsp. houtenae)和腸沙門(mén)氏菌雙亞利桑那亞種(Salmonella enteritidis subsp. diarizonae)。由于沙門(mén)氏菌分型繁多，到目前為止已確定的沙門(mén)氏菌的血清型就超過(guò)2500個(gè)[4]。沙門(mén)氏菌的致病性和菌產(chǎn)生毒力因子密切相關(guān)，其主要的毒力因子有毒力質(zhì)粒、脂多糖、菌毛等。

據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年有超過(guò)1億人感染沙門(mén)氏菌，因此而死亡人數(shù)超過(guò)15萬(wàn)。尤其在畜牧食品領(lǐng)域發(fā)生過(guò)許多重大事件。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的細(xì)菌性食物中毒事件中有70~80%都是由沙門(mén)氏菌引起。雖然在藥品領(lǐng)域出現(xiàn)沙門(mén)氏菌污染事件并不多，但依然值得我們加以重視。

檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）

檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)也叫枸櫞酸桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性桿菌，屬于腸桿菌科，周鞭毛運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，是一種常見(jiàn)的腸道細(xì)菌，菌落光滑、低凸、濕潤(rùn)、半透明或不透明，呈灰色，表面光滑，邊緣整齊，氧化酶陰性，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，化能有機(jī)異樣，多數(shù)菌株可利用檸檬酸作為唯一碳源，無(wú)賴(lài)氨酸脫羧酶，不能分解海藻酸和果膠酸鹽，可利用D-葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生酸和氣體，甲基紅測(cè)試陽(yáng)性，VP實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，常見(jiàn)于人和動(dòng)物的糞便，也可在土壤、水和食物出現(xiàn)。

檸檬桿菌屬(Citrobacter)最早被人們稱(chēng)為弗勞地埃希菌 “Escherichia freundii”，是被包含在埃希氏菌屬中，1958年開(kāi)始被列為獨(dú)立的菌屬，最早只有弗勞地氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)1個(gè)種，直到1986年才多出了2個(gè)新種。目前伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)中收入11個(gè)種，包括：弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，科氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri)，無(wú)丙二酸鹽檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus)，法氏檸檬酸桿菌(Citrobacter farmeri)，楊氏檸檬酸桿菌(Citrobacter younge)，布氏檸檬酸桿菌(Citrobacter braakii)，魏氏檸檬酸桿菌(Citrobacter werkmanii)，塞氏檸檬酸桿菌(Citrobacter sedlakii)，嚙齒檸檬酸桿菌(Citrobacter rodentium)，吉氏檸檬酸桿菌(Citrobacter gillienii)，默氏檸檬酸桿菌(Citrobacter murrlinae)。在2015年和2017年，又發(fā)現(xiàn)了Citrobacter pasteurii 和Citrobacter europaeus 兩個(gè)新種。檸檬酸桿菌屬種大多數(shù)的菌種都能夠在克氏雙糖鐵培養(yǎng)基和三糖鐵培養(yǎng)基中上產(chǎn)生H2S。

近年來(lái)研究表明，檸檬酸桿菌屬部分菌株也具有致病性，可能引起腹瀉、敗血癥、腦膜炎、呼吸道和泌尿道感染等疾病，其主要致病菌種是部分出現(xiàn)在臨床的弗氏檸檬酸桿菌株，它的抗原類(lèi)型和沙門(mén)氏菌屬具有很高相似性。

檸檬桿菌屬除了能夠在沙門(mén)氏菌選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)外，還可在其他培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，如志賀氏選擇培養(yǎng)基，脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基、亮綠瓊脂培養(yǎng)基，亞硫酸鉍培養(yǎng)基等。但是并非所有檸檬酸桿菌都能夠產(chǎn)生H2S，根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)介紹，11種檸檬酸桿菌之間生理生化特性存在較大的差異，如下表所示C. farmeri、C. koseri、C. rodentium、C. sedlakii無(wú)法產(chǎn)生H2S； C. koseri和C. rodentium菌種無(wú)法在KCN培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；C. braakii、C. farmeri、C. koseri、C. rodentium、 C. sedlakii、C. amalonaticus可以利用鳥(niǎo)氨酸；C. younge、C. braakii、C. farmeri、 C. murrlinae無(wú)法利用丙二酸鹽；但是研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌屬11個(gè)種都可以利用檸檬酸鹽。

兩屬的理化特性比較

許多研究表明，沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)之間生理生化反應(yīng)有許多相似之處。因此，在第二版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》的檸檬酸桿菌屬這篇中，出現(xiàn)了許多與沙門(mén)氏菌屬相似的理化特性介紹。如大部分菌種氧化酶測(cè)試、脂肪酶、苯丙氨酸脫氨酶都呈陰性，能利用檸檬酸酸鹽，而且可以利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣等重要理化特性。

當(dāng)然，通過(guò)整理我們也發(fā)現(xiàn)了檸檬酸桿菌屬和沙門(mén)氏菌屬在理化特性上的主要差異在吲哚測(cè)試、KCN 生長(zhǎng)、蔗糖利用、乳糖利用、尿素分解、賴(lài)氨酸脫羧酶上：檸檬酸桿菌屬大部分菌種，吲哚測(cè)試陽(yáng)性，可在KCN 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，另外可以利用蔗糖、乳糖以及分解尿素；而沙門(mén)氏菌大多數(shù)菌種則吲哚測(cè)試陰性，無(wú)法在KCN 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，不能利用蔗糖、乳糖以及分解尿素，但是沙門(mén)氏菌屬中大部分菌種賴(lài)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，而檸檬酸桿菌屬是陰性。

2015版《中國(guó)藥典》中，控制菌檢查法——沙門(mén)氏菌檢查法中，采用木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的篩菌及顯色來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌。首先，利用木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中脫氧膽酸鹽鈉抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)來(lái)篩菌；然后基于菌種能夠產(chǎn)生H2S的特性，以及H2S和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)顯色來(lái)鑒定沙門(mén)氏菌。三糖鐵培養(yǎng)基中分離鑒定的原理是根據(jù)腸桿菌科對(duì)糖的利用和硫化氫的產(chǎn)生來(lái)鑒定的。三糖是指該培養(yǎng)基中的乳糖、蔗糖和葡萄糖，大致比例為10:10:1，鐵是指硫酸亞鐵。沙門(mén)氏菌在三糖鐵培養(yǎng)基中利用微量葡萄糖，產(chǎn)生少量酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基先變黃，在接觸空氣后被氧化又變成紅色（另外，沙門(mén)氏菌還可利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性物質(zhì)，也可使培養(yǎng)基變成紅色，如果菌株能夠大量利用乳糖和蔗糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)基菌落會(huì)顯黃色）。

此外，一個(gè)重要顏色反應(yīng)是沙門(mén)氏菌可利用培養(yǎng)基中硫代硫酸鹽和氨基酸類(lèi)產(chǎn)生H2S，產(chǎn)生的H2S和硫酸亞鐵反應(yīng)生成黑色的硫化亞鐵，所以菌落大都呈現(xiàn)邊緣紅色中間黑色的形態(tài)，如下圖一。所以，如果有些菌株能夠利用葡萄糖產(chǎn)酸，以及能夠利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S，如部分檸檬酸桿菌，則會(huì)在選擇性培養(yǎng)基中呈現(xiàn)和沙門(mén)氏菌一致的狀態(tài)。我們對(duì)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》檸檬酸桿菌和沙門(mén)氏菌的理化特性進(jìn)行的整理比較發(fā)現(xiàn)，所示兩種菌屬都可以產(chǎn)生H2S（見(jiàn)表1和表2），因此沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基中出現(xiàn)檸檬酸桿菌屬具備合理性。正由于可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，藥典沙門(mén)氏菌檢測(cè)法中也強(qiáng)調(diào)了如果三糖鐵培養(yǎng)基中出現(xiàn)疑似沙門(mén)氏菌時(shí)，仍需要進(jìn)一步進(jìn)行其他適宜的鑒定試驗(yàn)。

兩屬分子水平比較

檸檬酸桿菌屬和沙門(mén)氏菌屬，除了理化性質(zhì)上相似外，其整體基因組特性也有一定的相似性，Alyssa M. Walterson 和 John Stavrinides 等人通過(guò)將腸桿菌科中各個(gè)屬內(nèi)的整個(gè)物種群的全基因組的共享蛋白同源物進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析（見(jiàn)圖二），檸檬酸桿菌屬和沙門(mén)氏菌屬最為接近，其次是埃希氏菌屬(Escherichia)，這表明兩屬的基因組背景較為相似。但是，我們對(duì)檸檬酸桿菌屬11個(gè)種，以及沙門(mén)氏菌屬2個(gè)種的16S rDNA序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，其16Sr DNA序列具有許多位點(diǎn)差異（見(jiàn)圖三），兩個(gè)菌屬可以利用16Sr DNA分開(kāi)。這說(shuō)明16S rDNA序列可以用來(lái)鑒定區(qū)分沙門(mén)氏菌屬和檸檬酸桿菌屬。

沙門(mén)氏菌和部分檸檬桿菌屬通過(guò)代謝產(chǎn)生H2S具有相似的遺傳基礎(chǔ)。研究表明，沙門(mén)氏菌屬之所以可利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S，是由于硫代硫酸鹽還原酶（Thiosulfate Reductase Gene，PHS）參與其重要活動(dòng)，編碼該還原酶的基因活性受到硝酸鹽的影響，如果在培養(yǎng)基中添加10mm硝酸鹽，可以阻止菌株產(chǎn)生H2S[14],[15]。為進(jìn)一步了解PHS基因特點(diǎn)，我們從NCBI上下載了4個(gè)菌株的全基因組，分別是：弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii CFNIH1)、腸沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica ATCC18)、科氏檸檬酸桿菌(Citrobacter Koseri ATCC BAA-895)和陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae ATCC 13047)。以往的理化研究表明，科氏檸檬酸桿菌和陰溝腸桿菌通常都不會(huì)利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S，而弗氏檸檬酸桿菌和腸沙門(mén)氏菌通常都會(huì)利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S。通過(guò)全基因組分析發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundiiCFNIH1)和腸沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica ATCC18)都擁有三個(gè)連續(xù)的PHS基因（2個(gè)PHS基因較短，1個(gè)PHS基因較長(zhǎng)）（見(jiàn)圖四）；而科氏檸檬酸桿菌(Citrobacter Koseri ATCC BAA-895)只有一個(gè)PHS基因，且片段較短；陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae ATCC 13047)則沒(méi)有PHS基因。這表明沙門(mén)氏菌和檸檬酸桿菌之所以可以利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S，可能是受到這三個(gè)連續(xù)的PHS基因調(diào)控。

此外，我們分離得到一株能夠在沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且理化現(xiàn)象疑似沙門(mén)氏菌的菌株（我們命名為YSSM），通過(guò)16S rDNA序列鑒定為——弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其基因組中也含有3個(gè)連續(xù)的PHS基因，且和上述2種菌(Citrobacter freundii CFNIH1、Salmonella enterica ATCC18)具有相似的PHS基因結(jié)構(gòu)（2個(gè)PHS基因較短，1個(gè)PHS基因較長(zhǎng)），這表明無(wú)論沙門(mén)氏菌還是檸檬酸桿菌，三個(gè)連續(xù)PHS基因可能是利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S的關(guān)鍵基因。

總結(jié)和討論

綜上所述，沙門(mén)氏菌屬和檸檬酸菌屬在生理、生化特性上有許多相似性，如氧化酶測(cè)試、脂肪酶、苯丙氨酸脫氨酶都呈陰性，大部分菌種都能利用檸檬酸酸鹽，而且都可以利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S（這也是造成沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基出現(xiàn)假陽(yáng)性的主要原因）。另外兩菌屬之間也存在許多不同之處，如在吲哚測(cè)試、KCN 生長(zhǎng)、蔗糖利用、乳糖利用、尿素分解、賴(lài)氨酸脫羧酶上，其中檸檬酸桿菌屬大部分菌種，吲哚測(cè)試陽(yáng)性，可在KCN 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，另外可以利用蔗糖、乳糖以及分解尿素，而沙門(mén)氏菌大多數(shù)菌種則吲哚測(cè)試陰性，無(wú)法在KCN 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，不能利用蔗糖、乳糖以及分解尿素，但是沙門(mén)氏菌屬中大部分菌種賴(lài)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，而檸檬酸桿菌屬是陰性。

因此，2015版藥典中也明確提到，當(dāng)三糖鐵培養(yǎng)基中出現(xiàn)疑似沙門(mén)氏菌的菌落時(shí)，仍然需要進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，因?yàn)槔砘匦匀菀资艿酵饨绛h(huán)境和菌株本身生長(zhǎng)狀態(tài)等多種因素影響，所以不排除假陽(yáng)性。

在整體基因組水平，沙門(mén)氏菌屬和檸檬酸菌屬也有一定的相似性，通過(guò)將腸桿菌科中各個(gè)屬內(nèi)的整個(gè)物種群的全基因組的共享蛋白同源物進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，檸檬酸桿菌屬和沙門(mén)氏菌最為接近，其次是埃希氏菌屬。此外，我們通過(guò)比較16S rDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，檸檬酸桿菌屬下面11個(gè)種和沙門(mén)氏菌屬下面2個(gè)種之間存在差異位點(diǎn)，可以利用16S rDNA序列來(lái)區(qū)分檸檬酸桿菌屬和沙門(mén)氏菌屬。

我們還對(duì)5株菌——弗氏檸檬酸桿菌、腸沙門(mén)氏菌、科氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌和本實(shí)驗(yàn)的YSSM（實(shí)際為弗氏檸檬酸桿菌）的基因組分析發(fā)現(xiàn)，理論上能產(chǎn)生H2S的菌株，其基因組上都具有三個(gè)連續(xù)的PHS基因，這可能就是沙門(mén)氏菌屬和檸檬酸菌屬利用硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S的關(guān)鍵基因。

信息來(lái)源： 微生物所編輯部  微生物研究所 公眾號(hào)