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OD600 和麥氏濁度知多少？

發(fā)布時間：

2025-04-30

在微生物實驗中，準確測定細菌濃度至關重要，無論是誘導蛋白表達時確定最佳時機、做藥敏試驗時標準化接種量，還是培養(yǎng)基驗收時接種定量菌液，都依賴于精準的細菌濃度數(shù)據(jù)。目前，OD 值測定與麥氏濁度（McFarland）法均能實現(xiàn)細菌濃度的定量分析，那么這兩種方法具體有哪些差異？實驗室又該如何根據(jù)需求選擇合適的測定方法呢？

一、OD值

1. OD值不是“濃度”，但它和濃度有關！

很多人會以為OD值就是濃度，其實不完全對。OD值實際是“光密度”的縮寫（optical density，OD），用來衡量溶液對光的吸收程度。當 600nm 的光穿過菌液，細菌越多，光被散射和吸收得越多，OD600 值就越高。

雖然OD值和菌液濃度有關系，但不是一一對應的，尤其在高OD值時，這種關系會變得不線性，因為OD值反映的是總細胞密度，包括活菌、死菌和細胞碎片，若培養(yǎng)過程中出現(xiàn)細胞死亡（如污染、培養(yǎng)時間過長），OD600 值可能虛高，誤導實驗判斷（如誤判為對數(shù)生長期）。

?? 注意：OD 值≠活菌數(shù)！它反映總細胞密度（包括死菌和碎片），需結合平板計數(shù)校準。而且OD600 測前先混勻！細菌抱團或沉淀會讓結果不準，建議用槍吹打 10 次再測。

2. 為什么選 OD600？

? 干擾少：600nm 是可見光，不是紫外光，不會被 LB、TSB 等培養(yǎng)基的淺黃色吸收，也不會損傷細菌。

? 線性好：波長越短（例如500nm），光散射越強，靈敏度越高，但線性范圍變窄；波長越長（如800nm）則相反。600nm是兼顧靈敏度和寬線性范圍的折中選擇，懸浮細胞越多，散射越強，OD值越高。

? 歷史慣性：早期分光光度計常用鎢燈作為光源，其在400-700nm范圍內(nèi)光強穩(wěn)定，600nm成為默認選項并沿用至今。

? 標準化：OD600是微生物學實驗中廣泛采用的標準方法，分子克隆、發(fā)酵工程都離不開它。制備感受態(tài)細胞時，OD600=0.6~0.8 是最佳時機。

? 特殊情況需要其他波長進行測量：例如酵母或大型細胞，推薦使用更高的波長（如波長660nm），可以有效減少多次散射干擾。

3. 分光光度計 vs 酶標儀，怎么選？

分光光度計和酶標儀都是利用朗伯-比耳定律，測定樣本的吸光度。

根據(jù)實驗室實際情況進行選擇

4、分光光度計明明只有吸光度A（Absorbance）的功能，為何卻可以將吸光度A當作OD值呢？

OD值是入射光與透射光比值的對數(shù)，或者說是光線透過率倒數(shù)的對數(shù)。定義式為：

L ——光穿過樣品的距離，即樣品的厚度（可以認為是比色皿的寬），單位厘米（cm）;

A_λ ——波長為λ處的吸光度（Absorbance）由分光光度計直接測出

T ——每單位的透射率（transmittance）

I₀ ——入射光的強度

I ——透射光束的強度

在這里，我們可以看到，光密度的定義式中，分母l實際上是一個光經(jīng)過的距離。在實際操作中，我們會使用使用寬度為1 cm的比色皿來進行實驗。進而，這個距離便被人為的設置為了1。因此，便出現(xiàn)了“分光光度計測定OD值”這樣的表述。

4. 不同儀器同一樣本測值不同？

有的同學發(fā)現(xiàn)，同一菌液在不同儀器上測的 OD 值會不一樣，這是因為儀器的光學配置不同，正向光學系統(tǒng)使用單色光測量吸光度，而反向光學系統(tǒng)則利用多色輻射，光穿過樣品后，多色輻射會被分離為單個波長。正向光學系統(tǒng)的某些組件會導致測量 OD 值的差異：比如樣品與檢測器之間的距離、所用收集透鏡的尺寸和焦距、檢測器的面積和靈敏度等都會影響結果。

?? 解決辦法：固定儀器型號，每次用培養(yǎng)基空白調(diào)零，新菌株必做 “OD600 - 活菌數(shù)” 標準曲線（梯度稀釋涂平板，擬合公式：細胞數(shù) = K×OD600）

二、麥氏濁度：微生物界的 “標準化手冊”

1. 麥氏濁度管里是什么？

在沒有光度計的情況下，估算微生物樣品濁度的方法是使用麥氏濁度標準（McFarland turbidity standards）。實驗室里常見的麥氏濁度管，里面是聚苯乙烯微粒懸液或硫酸鋇懸液，按濁度分成 0.5、1、2 號等，最常用的 0.5 號，對應的細菌濃度大約是 1.5×10? CFU/mL（以大腸桿菌為例）。

用法：目視比濁法。將菌液與麥氏管并列于白色背景，透過液體觀察下方黑色線條，當模糊程度一致時，菌液濁度即匹配。

2. 麥氏密度計

作為制備細菌和真菌細胞懸液麥氏標準的替代方法，麥氏密度計是一種實用的實驗室設備。麥氏密度計經(jīng)校準后，可測量 0.3–6.0 麥氏單位范圍內(nèi)的濁度。

原理：與分光光度計一樣，麥氏密度計也基于光度法原理。將聚苯乙烯微粒懸浮于特定緩沖液中，使用光徑 1 cm 的分光光度計在 600 nm 或 625 nm 波長下（具體波長取決于所用標準品）調(diào)整至可接受的吸光度范圍。將細菌懸液濁度調(diào)整至與麥氏等效濁度標準品一致，可使細菌計數(shù)處于預期范圍內(nèi)。光密度以數(shù)字形式直接顯示為麥氏單位（McFarland）。

麥氏密度計的組成部件：光源、數(shù)字顯示屏、試管支架、電源開關和外部電源電纜。

3. 為什么藥敏試驗必須用麥氏濁度？國際標準說了算！

? CLSI（臨床和實驗室標準協(xié)會）規(guī)定：抗生素藥敏試驗菌液須調(diào)整至 0.5 號麥氏濁度（誤差 ±20%），否則藥敏結果可能不準，影響耐藥性判斷。

? 其他場景：發(fā)酵罐接種前快速粗調(diào)濃度，培養(yǎng)基性能驗證、細菌生化鑒定等需要統(tǒng)一濃度減少人為誤差?；鶎訉嶒炇覜]有分光光度計也能操作。

4. 麥氏濁度的五大 “軟肋”

① 顏色干擾：深黃 / 橙色或棕色培養(yǎng)基（如含色素的肉湯）會掩蓋濁度，需先做預試驗；

② 菌株差異：革蘭氏陽性菌（如葡萄球菌）細胞更大，相同麥氏號對應的 OD600 值比大腸桿菌高 10%-20%，需單獨校準；

③ 老化菌液：培養(yǎng)超 24 小時的菌液可能因自溶導致濁度虛高，實際活菌數(shù)不足；

④ 儀器依賴：用濁度計測麥氏單位時，需確保試管直徑與標準管一致；

⑤ 存儲條件：標準管要避光保存！光照會導致硫酸鋇沉淀，使用前需檢查是否有分層。

三、核心區(qū)別對比：一張表教你選對方法