微生物培養(yǎng)基配制與滅菌方法及步驟
發(fā)布時(shí)間：
2019-12-02
微生物培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類型，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營(yíng)養(yǎng)角度分析，微生物培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。為了達(dá)到特定要求的研究，需要進(jìn)行培養(yǎng)基配制和滅菌，那么微生物培養(yǎng)基該如何配制與滅菌呢?
培養(yǎng)基制備
1.配制溶液
向容器內(nèi)加入所需水量的一部分,按照培養(yǎng)基的配方,稱取各種原料,依次加入使其溶解,最后補(bǔ)足所需水分，對(duì)蛋白胨、肉膏等物質(zhì),需加熱溶解,加熱過程所蒸發(fā)的水分,應(yīng)在全部原料溶解后加水補(bǔ)足。
配制固體培養(yǎng)基時(shí),先將上述已配好的液體培養(yǎng)基煮沸,再將稱好的瓊脂加入,繼續(xù)加熱至完全融化.并不斷攪拌,以免瓊脂糊底燒焦。
2.調(diào)節(jié)pH值
用pH試紙(或pH電位計(jì)、氫離子濃度比色計(jì))測(cè)試培養(yǎng)基的pH值,如不符合需要,可用10%HCl或10%NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié),直到調(diào)節(jié)到配方要求的pH值為止。
3.過濾
用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養(yǎng)基過濾.用紗布過濾時(shí),最好折疊成六層,用濾紙過濾時(shí),可將濾紙折疊成瓦棱形,鋪在漏斗上過濾。
4.分裝
已過濾的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行分裝.如果要制作斜面培養(yǎng)基,須將培養(yǎng)基分裝于試管中.如果要制作平板培養(yǎng)基或液體、半固體培養(yǎng)基,則須將培養(yǎng)基分裝于錐形瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí),一手捏松彈簧夾,使培養(yǎng)基流出,另一只手握住幾支試管或錐形瓶,依次接取培養(yǎng)基。分裝時(shí),注意不要使培養(yǎng)基粘附管口或瓶口,以免浸濕棉塞引起雜菌污染。裝入試管的培養(yǎng)基量,視試管和錐形瓶的大小及需要而定.一般制作斜面培養(yǎng)基時(shí),每只15×150毫米的試管,約裝3～4毫升(1/4～1/3試管高度),如制作深層培養(yǎng)基,每只20×220毫米的試管約裝12～15毫升。每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基,一般以其容積的一半為宜。
5.加棉塞
分裝完畢后,需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過濾空氣,避免污染.棉塞應(yīng)采用普通新鮮、干燥的棉花制作,不要用脫脂棉,以免因脫脂棉吸水使棉塞無法使用。制作棉塞時(shí),要根據(jù)棉塞大小將棉花鋪展成適當(dāng)厚度,揪取手掌心大小一塊,鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中,用右手食指插入棉花中部,同時(shí)左手食指與姆指稍稍緊握,就會(huì)形成1個(gè)長(zhǎng)棒形的棉塞.棉塞作成后,應(yīng)迅速塞入管口或瓶口中,棉塞應(yīng)緊貼內(nèi)壁不留縫隙,以防空氣中微生物沿皺折侵入。棉塞不要過緊過松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落為合適。棉塞的2/3應(yīng)在管內(nèi)或瓶?jī)?nèi),上端露出少許棉花便于拔取。塞好棉塞的試管和錐形瓶應(yīng)蓋上厚紙用繩捆札,準(zhǔn)備滅菌。
6.制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基
培養(yǎng)基滅菌后,如制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基,須趁培養(yǎng)基未凝固時(shí)進(jìn)行。
(1)制作斜面培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放1支長(zhǎng)0.5～1米左右的木條,厚度為1厘米左右，將試管頭部枕在木條上,使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜,凝固后即成斜面培養(yǎng)基。
(2)制作平板培養(yǎng)基。將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,點(diǎn)燃酒精燈,右手托起錐形瓶瓶底,左手拔下棉塞,將瓶口在酒精燈上稍加灼燒,左手打開培養(yǎng)皿蓋,右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中,每皿約倒入10毫升,以鋪滿皿底為度.鋪放培養(yǎng)基后放置15分鐘左右,待培養(yǎng)基凝固后,再5個(gè)培養(yǎng)皿一疊,倒置過來,平放在恒溫箱里,24小時(shí)后檢查,如培養(yǎng)基末長(zhǎng)雜菌，即可用來培養(yǎng)微生物。
微生物檢查培養(yǎng)基常用的滅菌方法
1、濕熱滅菌：
蒸汽在冷凝時(shí)釋放出大量潛能，并且蒸汽具有強(qiáng)大穿透力，蒸汽的濕熱破壞菌體蛋白質(zhì)和核酸的化學(xué)鍵，使酶失活，微生物因代謝障礙而死亡。濕熱滅菌的效果，取決于致死溫度和致死時(shí)間。致死溫度是殺滅微生物的極限溫度。致死時(shí)間是在致死溫度下殺滅全部微生物所需時(shí)間。
高壓蒸汽滅菌適合于耐高溫培養(yǎng)基、接種器械和蒸餾水的滅菌。培養(yǎng)基分裝后應(yīng)立即滅菌，應(yīng)在當(dāng)天內(nèi)完成滅菌工作，不可過夜。消毒時(shí)間不宜過長(zhǎng)，也不能超過規(guī)定的壓力范圍，否則有機(jī)物質(zhì)就會(huì)在高溫下分解，失去營(yíng)養(yǎng)作用，也會(huì)使培養(yǎng)基變質(zhì)、變色，甚至難以凝固。
培養(yǎng)基配制后，應(yīng)按驗(yàn)證過的高壓滅菌程序滅菌。2015版《中國(guó)藥典》第三次公示稿，1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法中，列出部分培養(yǎng)基的滅菌條件，如下表所示：
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培養(yǎng)基名稱 |
滅菌條件 |
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腸道菌增菌液體培養(yǎng)基 |
加熱至100℃ 30分鐘，立即冷卻 |
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紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 |
加熱煮沸（不能在高壓滅菌器中加熱） |
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RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基 |
滅菌溫度不能超過115℃ |
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木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基 |
加熱至沸騰（不能在高壓滅菌器中加熱） |
其他未明確標(biāo)示滅菌方法的培養(yǎng)基，按供應(yīng)商標(biāo)簽所示滅菌方法滅菌或按驗(yàn)證過的高壓滅菌程序滅菌。
2、過濾除菌：
一些抗生素及有機(jī)物等，遇熱容易分解，不能與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高溫滅菌，而要使用細(xì)菌過濾器濾去其中的雜菌，例如含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。過濾后的溶液要立即加入培養(yǎng)基中，若為液體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)基冷卻至30℃時(shí)加入；若為固體培養(yǎng)基，必須在培養(yǎng)基凝固之前（50-60℃）加入，振蕩使溶液與其他成分混合均勻。
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