近年來(lái)，越來(lái)越多的法規(guī)、文獻(xiàn)，甚至是FDA的警告信中，都不斷提及在無(wú)菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證、清潔和消毒劑效能驗(yàn)證、無(wú)菌工藝驗(yàn)證等各種微生物相關(guān)的驗(yàn)證中，除了使用標(biāo)準(zhǔn)菌株以外，也應(yīng)當(dāng)使用企業(yè)自身環(huán)境中分離到的具有代表性的微生物進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

那么，哪些菌才具有代表性呢？

這就需要企業(yè)對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)中分離到的微生物進(jìn)行屬和種水平的鑒定（在超限時(shí)對(duì)采集到的微生物進(jìn)行鑒定，以及在未超限時(shí)進(jìn)行周期性的環(huán)境微生物鑒定），并且對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，以確定常見(jiàn)的微生物類型，然后根據(jù)微生物的種類特征和數(shù)量從中篩選，進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)然，環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)建立的意義不止于此，數(shù)據(jù)庫(kù)的建立有助于企業(yè)了解藥品生產(chǎn)過(guò)程中微生物的負(fù)載情況，對(duì)于建立有效的生產(chǎn)過(guò)程微生物污染溯源分析體系具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。

環(huán)境菌庫(kù)的應(yīng)用

我們（浙江省微生物研究所）對(duì)2017-2018年積累的環(huán)境微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，樣本采樣點(diǎn)絕大部分為相關(guān)企業(yè)潔凈區(qū)或其他受控環(huán)境，涵蓋制藥、食品、化妝品等行業(yè)，其中以制藥企業(yè)為主?；诒Ｃ茉?，我們并不要求企業(yè)提供詳細(xì)采樣地點(diǎn)，但通過(guò)對(duì)歷史數(shù)據(jù)的分析，我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)了一些有意思的東西，與大家分享。

細(xì)菌真菌檢測(cè)比例變化趨勢(shì)

2018年全年真菌月度平均檢出率為11.4%，這一數(shù)值高于隨機(jī)抽取的10家環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)情況較好的制藥企業(yè)的真菌檢出率（3%-6%）。對(duì)此，我們并不意外，相比于細(xì)菌多種多樣的鑒定手段，真菌的鑒定手段就顯得匱乏一些。因此，企業(yè)在分離到真菌時(shí)，更傾向于委托給我們鑒定。
菌群相關(guān)性分析我們對(duì)兩年來(lái)鑒定到種或?qū)偎降木N（細(xì)菌鑒定率為98.88%，真菌鑒定率為96.89%）進(jìn)行了聚類分析。眾所周知，環(huán)境中的微生物并非獨(dú)立存在，各個(gè)微生物種屬直接存在著復(fù)雜的互作關(guān)系。企業(yè)在環(huán)境監(jiān)測(cè)中采集到的微生物主要體現(xiàn)為兩類關(guān)系：一類是Win-Win的互惠關(guān)系，一類是Win-lose的抑制關(guān)系；具有互惠關(guān)系的微生物傾向于共同被檢出，而相互抑制的微生物則可能呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。

潔凈環(huán)境中檢出的微生物大致可以分為3類：

①與人員攜帶相關(guān)：如葡萄球菌屬（Staphylococcus）、 微球菌屬（Micrococcus）、 短桿菌屬（Brevibacterium）、 莫拉氏菌屬（Moraxella）、 考克氏菌屬（Kocuria）、 皮膚球菌屬（Kytococcus）等，生境主要與人體相關(guān)，在這些菌屬的檢出率上也反映出了一定的正相關(guān)性；

②與水系統(tǒng)相關(guān)：如羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、 鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、 甲基桿菌屬（Methylobacterium）、 微桿菌屬（Microbacterium）、 污泥單胞菌屬（Pelomonas）等生境主要為水體，?？稍谒到y(tǒng)中以形成生物膜的積聚，到一定規(guī)模時(shí)可能造成管道堵塞。

③與土壤相關(guān)：如芽孢桿菌屬（Bacillus）、 類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、 賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus），這些菌屬都具有較強(qiáng)的抗消殺能力，可能為該潔凈室的土著菌屬，也可能由物料、設(shè)備包裝等因素?cái)y帶進(jìn)入潔凈環(huán)境。

從上圖，我們不難看出，不同種屬的微生物之間，以某種方式聯(lián)系在一起。例如，可能為同一來(lái)源的微生物具有共同檢出的傾向。而定殖菌之間可能存在互惠互利的現(xiàn)象，從而實(shí)現(xiàn)在潔凈室環(huán)境的持留。
優(yōu)勢(shì)菌種對(duì)比

我們對(duì)比了2017-2018年檢出率超過(guò)1%的菌種，發(fā)現(xiàn)兩年優(yōu)勢(shì)菌屬和菌種均十分相似。這表明盡管地域、氣候等因素對(duì)菌群結(jié)構(gòu)存在一定的影響，但遵循GMP體系的受控生產(chǎn)環(huán)境總體是具有較高的相似性，因此環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌構(gòu)成也存在著一定的相似性。這也表明，在持續(xù)受控的環(huán)境中，菌群結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)是具有穩(wěn)定性的。研究各個(gè)企業(yè)、各個(gè)時(shí)間這種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的變化可能有助于我們對(duì)環(huán)境微生物管控水平進(jìn)行更精確，更數(shù)據(jù)化的評(píng)估。

未知菌屬的分類和溯源無(wú)論采用何種的鑒定方法，能否鑒定到種或?qū)?，其?shí)都取決于該方法所依托的背景數(shù)據(jù)庫(kù)的大小。然而無(wú)論多大的數(shù)據(jù)庫(kù)均有其局限性，一旦分離到的菌未被背景數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，我們就無(wú)法獲得其種屬信息。但是，采用基因序列方法進(jìn)行微生物鑒定的優(yōu)勢(shì)在于，即使我們無(wú)法獲得種屬信息，我們依然可以依據(jù)其基因序列的相似性進(jìn)行物種的劃分。因此，我們對(duì)未鑒定到種屬的細(xì)菌（1.12%）和真菌（3.11%）也從序列水平進(jìn)行了分類。

從兩年的數(shù)據(jù)中，我們根據(jù)基因序列的相似度，一共得到了細(xì)菌97%相似度水平集合113個(gè)，99%相似度水平集合218個(gè)，真菌97%相似度水平集合45個(gè)，99%相似度水平集合50個(gè)。這個(gè)數(shù)量顯然是小于我們實(shí)際的未知菌檢出數(shù)量的，這意味著，有一些未知菌是多次被檢出的（上圖中色塊大小代表97%相似度水平集合的檢出頻次）。這意味著，即便污染菌的鑒定結(jié)果是未知菌屬，我們也可以通過(guò)序列相似度的比較，進(jìn)行基因水平的溯源分析。同時(shí)，如果對(duì)一些常見(jiàn)未知菌的特性進(jìn)行進(jìn)一步研究，可能有助于我們更好的管控生產(chǎn)環(huán)境的微生物風(fēng)險(xiǎn)。

特定菌屬的回顧分析除了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以外，我們也可以利用歷史數(shù)據(jù)運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段進(jìn)行一些菌群動(dòng)態(tài)趨勢(shì)的預(yù)測(cè)。如下圖

2017-2018年芽孢桿菌屬（Bacillus）的總體平均檢出率在13.8%左右，總體月度波動(dòng)較小。對(duì)比單個(gè)企業(yè)的抽樣數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)菌藥品生產(chǎn)企業(yè)的芽孢檢出率普遍低于10%，一般在6%~8%之間，非無(wú)菌制劑和中藥企業(yè)的檢出率則根據(jù)管控情況不同存在較大波動(dòng)，一般在15%~30%之間，不排除芽孢桿菌檢出率較高的企業(yè)存在選擇性送樣的情況。另外，我們可以依據(jù)趨勢(shì)推測(cè)，在未來(lái)1-2個(gè)月的芽孢桿菌總體檢出情況應(yīng)當(dāng)會(huì)保持在13-14%%左右，若實(shí)際數(shù)據(jù)與此出現(xiàn)較大偏離時(shí)，可能意味著有不受控情況出現(xiàn)。

后  記

制藥生產(chǎn)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)微生物是人源的革蘭氏陽(yáng)性桿菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，真菌則是酵母和絲狀真菌，我們的數(shù)據(jù)也體現(xiàn)了這一點(diǎn)。同時(shí)，我們也在來(lái)源于水環(huán)境的菌中，發(fā)現(xiàn)了一些革蘭氏陰性桿菌，它們通常具有條件致病性，如粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens，又稱褪色沙雷氏菌）。如果企業(yè)的水系統(tǒng)中有這些菌的存在，會(huì)帶來(lái)極高的終產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)。

我們通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取了2017-2018年腸桿菌屬、粘質(zhì)沙雷菌的檢出數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)月平均檢出率分別為0.6%、0.1%，這個(gè)表明目前國(guó)內(nèi)企業(yè)，對(duì)這些菌的管控非常到位。產(chǎn)品中污染的微生物來(lái)自于原料，環(huán)境和人員的相互作用。因此，從原材料、環(huán)境、人員和產(chǎn)品中分離檢測(cè)并準(zhǔn)確鑒定其中的微生物，分析微生物的特性，和變化趨勢(shì)，是實(shí)現(xiàn)微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管控的基礎(chǔ)。通過(guò)建立環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)，確定對(duì)應(yīng)企業(yè)自身產(chǎn)品的“不可接受微生物”列表，才能更有效地驗(yàn)證生產(chǎn)工藝或者消殺是否能夠有效控制原料或者環(huán)境來(lái)源的“不可接受微生物”，避免其最終污染產(chǎn)品。

后記

經(jīng)過(guò)連續(xù)幾年的制藥環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)實(shí)踐，我們發(fā)現(xiàn)雖然相比于自然環(huán)境，潔凈環(huán)境的微生物種類更少，優(yōu)勢(shì)菌群占比更高，菌群面臨的生存脅迫更大，但潔凈環(huán)境的微生態(tài)仍具有其獨(dú)特的多樣性和穩(wěn)定性。雖然存在地域差異、產(chǎn)品差異等因素，但各企業(yè)潔凈環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌群仍具有一定的相似性，且在一定程度上遵循“二八原則”，既20%的優(yōu)勢(shì)菌屬占總檢出率的80%。
    這使得我們利用已知環(huán)境微生物數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)情況，通過(guò)優(yōu)勢(shì)菌群的變化來(lái)指導(dǎo)微生物管控計(jì)劃，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)比較不同企業(yè)間的微生物管控水平成為可能。

信息來(lái)源： 微生物所編輯部 微生物研究所  公眾號(hào)