細(xì)胞污染鑒別、處理技能全get
發(fā)布時(shí)間：
2021-08-14
細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細(xì)菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細(xì)胞污染。
細(xì)胞培養(yǎng)中污染的特點(diǎn)如下
細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。
支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會渾濁，原體感染，國內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。
黑膠蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運(yùn)動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。
真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。
原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會影響到細(xì)胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。
病毒：組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。
盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
非同種細(xì)胞污染 ：即是細(xì)胞交叉污染，由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。
洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌，因引起洋蔥患病而得名，是醫(yī)院感染病原菌之一。
洋蔥伯克霍爾德菌是一種廣泛存在于土壤及水中，與醫(yī)院感染密切相關(guān)的革蘭陰性桿菌，尤其為免疫缺陷及肺囊性纖維化患者易感染細(xì)菌之一。它可以在無糖的培養(yǎng)基中生長。在醫(yī)院環(huán)境中?？晌廴咀詠硭?、體溫表、噴霧器、靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管、靜脈輸液管等，造成院內(nèi)傳播，導(dǎo)致多種醫(yī)院感染，如敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、傷口感染、深部膿腫和眼結(jié)膜炎等，尤其采用導(dǎo)管植入進(jìn)行治療者，更容易引起感染。洋蔥伯克霍爾德菌對多種抗菌藥具有天然的耐藥性。耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，治療可選擇復(fù)方磺胺甲繟唑、哌拉西林,三唑巴坦、哌拉西林和頭孢他啶等抗菌藥物。
白色念珠菌污染（倒置）， 白色鏈球菌是常見的細(xì)胞污染
污染來源，一般是來自實(shí)驗(yàn)服，并且具有季節(jié)性，像現(xiàn)在這種長蘑菇的季節(jié)很容易污染這種菌類。
鏡下能隱約看到出芽生殖，不過不知道酵母會不會呈團(tuán)聚集在一起，因?yàn)檎掌心菆F(tuán)黃色的東西也是此污染物，肉眼觀察使可看到明顯的白色或淡黃色顆粒狀的漂浮物，同樣這個(gè)污染源也是小鼠的皮膚
污染的清除
培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之;在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞，再培養(yǎng)。
若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。
一、細(xì)菌和真菌的清除
使用抗生素
抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。
二、支原體的清除
1、用MRA處理
用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細(xì)胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康，效果好。
2、用清洗純化法清除支原體污染的方法
細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌
其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限。
如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。
3、藥物輔助加溫處理
先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。
4、使用支原體特異性血清
用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。
污染的預(yù)防
預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。
一般預(yù)防可從以下幾方面著手：
1、添加抗生素
2、從物品、用品消毒滅菌著手
細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。
操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。
3、從操作者做起
(1)進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手，按規(guī)定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
(2)操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。
(3)操作時(shí)要常更換吸管，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。
4、防止細(xì)胞交叉污染
在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分。
在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。
細(xì)胞一旦購置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。
5、無菌室的徹底消毒
1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室;
2)甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。
信息來源：https://mp.weixin.qq.com/s/6In73FRdHEqvBuxm_oK6-w
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