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細(xì)胞污染鑒別、處理技能全get


發(fā)布時(shí)間:

2021-08-14

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種,分別是細(xì)菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細(xì)胞污染。

 

 

細(xì)胞培養(yǎng)中污染的特點(diǎn)如下

                 

細(xì)菌:細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,根據(jù)感染細(xì)菌的不同,可有不同的外形,培養(yǎng)液一般會渾濁變黃,對細(xì)胞生長影響明顯。

 

支原體:黑色的,好象多為多形,培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會渾濁,原體感染,國內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測,而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后,細(xì)胞病變不很明顯,只是慢慢死去。

 

黑膠蟲:可以穿透濾膜,也可以通過空氣傳播,低倍下為黑色點(diǎn)狀,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,培養(yǎng)液也是不渾的,一般不會太影響,細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好,且觀測到的運(yùn)動物無明顯增多,且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化,可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會有明顯影響,在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失,除更換血清外無須特殊處理。

 

真菌:一般培養(yǎng)液清亮,不變色,鏡下有絲狀物,有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片,只是它很多很多的小塊很清楚,象珊瑚狀,不象細(xì)胞碎片分不清,慢慢的會長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢,不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn),但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了,也很難救活了。

 

原蟲:培養(yǎng)液可輕微渾濁,顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多,輕微活動,細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,而且細(xì)胞狀態(tài)不好,邊緣不清楚,細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的,但他們的數(shù)量小,細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長,只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會影響到細(xì)胞的生長,最終形成惡性循環(huán)。

 

病毒:組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中,如果沒有除去潛在的病毒,就會產(chǎn)生病毒污染。目前,從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。

盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng),但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此,潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

 

非同種細(xì)胞污染 :即是細(xì)胞交叉污染,由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開,往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前,世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染,致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生,大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。



洋蔥佰克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)原屬假單胞菌屬,是植物病原菌,因引起洋蔥患病而得名,是醫(yī)院感染病原菌之一。

 

洋蔥伯克霍爾德菌是一種廣泛存在于土壤及水中,與醫(yī)院感染密切相關(guān)的革蘭陰性桿菌,尤其為免疫缺陷及肺囊性纖維化患者易感染細(xì)菌之一。它可以在無糖的培養(yǎng)基中生長。在醫(yī)院環(huán)境中??晌廴咀詠硭?、體溫表、噴霧器、靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管、靜脈輸液管等,造成院內(nèi)傳播,導(dǎo)致多種醫(yī)院感染,如敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、傷口感染、深部膿腫和眼結(jié)膜炎等,尤其采用導(dǎo)管植入進(jìn)行治療者,更容易引起感染。洋蔥伯克霍爾德菌對多種抗菌藥具有天然的耐藥性。耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,治療可選擇復(fù)方磺胺甲繟唑、哌拉西林,三唑巴坦、哌拉西林和頭孢他啶等抗菌藥物。

 

 

白色念珠菌污染(倒置), 白色鏈球菌是常見的細(xì)胞污染

 

 

 

 

 

 

 

污染來源,一般是來自實(shí)驗(yàn)服,并且具有季節(jié)性,像現(xiàn)在這種長蘑菇的季節(jié)很容易污染這種菌類。



 

 

 

 

鏡下能隱約看到出芽生殖,不過不知道酵母會不會呈團(tuán)聚集在一起,因?yàn)檎掌心菆F(tuán)黃色的東西也是此污染物,肉眼觀察使可看到明顯的白色或淡黃色顆粒狀的漂浮物,同樣這個(gè)污染源也是小鼠的皮膚

污染的清除

                 

培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染,多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大,宜棄之;在尋找原因后徹底消毒操作室,復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞,再培養(yǎng)。

 

若污染細(xì)胞價(jià)值較大,又難于重新得到,可采取以下辦法清除。

 

一、細(xì)菌和真菌的清除

 

使用抗生素

 

抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素,污染后清除用藥需采用大于常用量510倍的沖洗法,于加藥后作用2448小時(shí),再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。

 

二、支原體的清除

 

1、用MRA處理

 

MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細(xì)胞,每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康,效果好。

 

2、用清洗純化法清除支原體污染的方法

 

細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌

 

其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限。

 

如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用,可達(dá)到更好的效果。

 

3、藥物輔助加溫處理

 

先用藥物處理后,再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí),可殺死支原體,但對細(xì)胞有不良影響。

 

4、使用支原體特異性血清

 

5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩,不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。

 

污染的預(yù)防

                 

預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前,才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。

 

一般預(yù)防可從以下幾方面著手:

 

1、添加抗生素

 

2、從物品、用品消毒滅菌著手

 

細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底,各種溶液滅菌除菌要仔細(xì),并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。

 

操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

 

3、從操作者做起

 

(1)進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手,按規(guī)定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

 

(2)操作者動作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時(shí)盡量不要談話,若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

 

(3)操作時(shí)要常更換吸管,一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

 

4、防止細(xì)胞交叉污染

 

在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí),所用器具要嚴(yán)格區(qū)分。

 

在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí),注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口,以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。

 

細(xì)胞一旦購置或從別處引入,均應(yīng)及早留種凍存,一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。

 

5、無菌室的徹底消毒



1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室;

 

2)甲醛熏蒸法:甲醛是一種廣譜滅菌劑菌,其水溶液和氣休對各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。 

 

信息來源:https://mp.weixin.qq.com/s/6In73FRdHEqvBuxm_oK6-w

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