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原題: Insight in lag phase of Listeria monocytogenes during enrichment through proteomic and transcriptomic responses

譯名：通過蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)反應(yīng)深入了解單核細(xì)胞增生李斯特菌在富集培養(yǎng)期間的滯后期

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摘要

本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析食源性病原菌單核細(xì)胞增生李斯特菌在富集培養(yǎng)滯后期的生理過程。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞從BHI培養(yǎng)的靜止期轉(zhuǎn)移至half-Fraser enrichment broth（HFB） 后，運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因和蛋白下調(diào)，金屬攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、復(fù)蘇促進(jìn)因子、抗生素外排泵和氧化應(yīng)激蛋白表達(dá)上調(diào)。熱應(yīng)激細(xì)胞在 HFB 中上調(diào) DNA 損傷修復(fù)、蛋白重折疊、細(xì)胞壁修復(fù)和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白。添加 10μM 鋅和補(bǔ)充含復(fù)蘇促進(jìn)因子的spent HFB 雖對(duì)滯后期有顯著輕微影響，但未達(dá)生物學(xué)相關(guān)的縮短效果，且 HFB 不缺關(guān)鍵底物。研究揭示滯后期蛋白組變化，表明補(bǔ)充 HFB 非優(yōu)化富集方法的最佳策略，為優(yōu)化富集方法提供新見解。

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前言

單核細(xì)胞增生李斯特菌是重要食源性病原菌，其檢測中富集培養(yǎng)階段至關(guān)重要。食品加工中細(xì)菌可能因應(yīng)激受損導(dǎo)致富集滯后期延長（即細(xì)菌適應(yīng)新環(huán)境的停滯階段），影響檢測效率。目前滯后期生理機(jī)制未被充分理解，本研究以 EGDe 株為對(duì)象，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)，解析非應(yīng)激與熱應(yīng)激細(xì)菌在 HFB 中滯后期的分子機(jī)制，為提升檢測效率提供理論依據(jù)。

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材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)菌株與培養(yǎng)條件

? 菌株：單核細(xì)胞增生李斯特菌 EGDe 株，在 BHI 培養(yǎng)基中 30℃、180rpm 培養(yǎng) 16h 至靜止期。

? 應(yīng)激處理：熱應(yīng)激組經(jīng) 60℃水浴處理 1.6min，參考組為非應(yīng)激細(xì)胞。

? 富集培養(yǎng)基：含萘啶酮酸的半 Fraser 肉湯（HFB），接種量分高濃度（7.7-8.2logCFU/ml）和低濃度（2logCFU/ml）。

2. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

? 取樣：參考細(xì)胞于 0、10min、30min、2h 取樣；熱應(yīng)激細(xì)胞于 0、30min、2h、4h、7h 取樣。

? 分析：SDS-PAGE 分離蛋白，LC-MS/MS 鑒定差異蛋白（p<0.05，|log?FC|>2），進(jìn)行 COG 功能分類及 KEGG 通路富集分析。

3. 代謝物檢測

? HPLC 分析：監(jiān)測 HFB 中碳水化合物、氨基酸、代謝產(chǎn)物濃度變化（0-24h），分析底物消耗動(dòng)力學(xué)及厭氧代謝產(chǎn)物積累。

4. 功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

? 金屬離子效應(yīng)：在 HFB 中添加 Zn2?、Co2?、Cu2?等，測定達(dá)到特定 OD 值的時(shí)間（TTR），評(píng)估對(duì)滯后期的影響。

? 廢培養(yǎng)基補(bǔ)充：收集含復(fù)蘇促進(jìn)因子（RPF）的無菌上清液，按比例混合新鮮 HFB，擬合生長曲線，模擬極低菌量富集效率。

5. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與建模

? 生長動(dòng)力學(xué)：用 Baranyi 模型擬合滯后期和指數(shù)生長期參數(shù)，分析顯著性差異（p<0.05）。

? 生物信息學(xué)：構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，注釋未鑒定蛋白，驗(yàn)證功能模塊關(guān)聯(lián)性。

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結(jié)果

3.1 高接種量下的滯后期

為解析單核細(xì)胞增生李斯特菌在 HFB 中的滯后期分子機(jī)制，將 EGDe 菌株在 BHI 中 30℃、180rpm 培養(yǎng) 16h 至靜止期，按高接種量（參考細(xì)胞 8.2 log CFU/ml、熱應(yīng)激細(xì)胞 7.7 log CFU/ml，60℃處理 1.6min）接種至 HFB。

通過 Baranyi 模型分析顯示，熱應(yīng)激細(xì)胞滯后期隨接種量升高而縮短（如 7.5 log CFU/ml 組滯后期短于 2 log CFU/ml 組）。

基于此差異，參考細(xì)胞于 0、10min、30min 及 2h（滯后期結(jié)束）取樣，熱應(yīng)激細(xì)胞于 0、30min、2h、4h 及 7h（覆蓋滯后期全程及向指數(shù)期過渡階段）取樣，為組學(xué)分析提供時(shí)間序列樣本。

3.2 滯后期的蛋白質(zhì)組學(xué)響應(yīng)

蛋白表達(dá)聚類分析顯示，參考細(xì)胞與熱應(yīng)激細(xì)胞在 HFB 中呈現(xiàn)顯著差異，且隨滯后期進(jìn)程分為早期 / 晚期階段。熱應(yīng)激細(xì)胞特有差異蛋白 106 種（共表達(dá) 15 種），參考細(xì)胞特有 39 種，54 種核心蛋白介導(dǎo)基礎(chǔ)適應(yīng)響應(yīng)。

共同適應(yīng)機(jī)制

? 能量重分配：下調(diào)鞭毛組裝（FlhA、MotB）及趨化蛋白，減少運(yùn)動(dòng)耗能（營養(yǎng)充足環(huán)境非必需）。

? 抗性與穩(wěn)態(tài)：上調(diào)抗生素外排泵（MepA）應(yīng)對(duì) HFB 選擇性壓力，激活鋅 / 鎂轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（ZurR 調(diào)控 Lmo1671、鎂 ATP 酶 Lmo2689）維持離子平衡。

? 復(fù)蘇啟動(dòng)：細(xì)胞壁結(jié)合復(fù)蘇因子 Lmo2522 顯著上調(diào)（2 h 時(shí) log? FC=9.9），其編碼基因 30 min 轉(zhuǎn)錄水平同步升高，促進(jìn)休眠細(xì)胞激活。

熱應(yīng)激特化修復(fù)

額外激活 106 種蛋白，聚焦多維度損傷修復(fù)：

? 蛋白 / DNA 修復(fù)：熱激蛋白 ClpB/E 處理錯(cuò)誤折疊蛋白，DNA 螺旋酶（Lmo0157）與 UvrABC 核酸酶系統(tǒng)修復(fù)熱誘導(dǎo)損傷。

? 細(xì)胞壁重構(gòu)：肽聚糖乙酰轉(zhuǎn)移酶 OatA（增強(qiáng)抗溶菌酶能力）、溶蛋白 Lmo2505 上調(diào)，恢復(fù)細(xì)胞壁完整性。

? 氧化應(yīng)激應(yīng)對(duì)：厭氧還原酶 Lmo0279（FC=14）、硫氧還蛋白 Lmo2152 高表達(dá)，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)

轉(zhuǎn)錄組顯示核糖體蛋白（30S/50S 亞基）5 min 內(nèi)快速上調(diào)（log? FC>3.5），預(yù)示翻譯機(jī)器早期合成；未注釋差異蛋白（log? FC≥4）功能待深入解析。綜上，細(xì)菌通過 “降耗能 - 強(qiáng)抗性 - 促復(fù)蘇” 級(jí)聯(lián)反應(yīng)適應(yīng)環(huán)境，熱應(yīng)激細(xì)胞需額外啟動(dòng)多維度修復(fù)通路。

3.3 熱應(yīng)激細(xì)胞的特異性修復(fù)響應(yīng)

熱應(yīng)激細(xì)胞在 HFB 中特異性上調(diào) 106 種蛋白（p<0.05，|log?FC|>2），富集于四大損傷修復(fù)通路：

1. 蛋白與 DNA 損傷修復(fù)

? 熱休克蛋白 ClpB（log?FC=4.1）和 ClpE（log?FC=3.8）通過 ATP 依賴機(jī)制復(fù)性 / 降解錯(cuò)誤折疊蛋白。

? DNA 螺旋酶 Lmo0157（log?FC=3.2）解旋受損 DNA，UvrABC 核酸酶系統(tǒng)（log?FC 2.3–2.8）修復(fù)熱誘導(dǎo)嘧啶二聚體，優(yōu)先恢復(fù)遺傳與蛋白穩(wěn)態(tài)。

2. 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)

? 肽聚糖乙酰轉(zhuǎn)移酶 OatA（log?FC=3.6）通過乙?；鰪?qiáng)抗溶菌酶能力，溶蛋白 Lmo2505（log?FC=3.1）參與肽聚糖交聯(lián)重構(gòu)，修復(fù)熱應(yīng)激導(dǎo)致的膜脂過氧化損傷。

3. 氧化應(yīng)激與滲透壓調(diào)控

? 厭氧還原酶 Lmo0279（log?FC=14.0）清除 ROS，硫氧還蛋白 Lmo2152（log?FC=3.3）修復(fù)二硫鍵，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。

? 鹽應(yīng)激蛋白 Lmo0529（log?FC=2.6）通過調(diào)控相容性溶質(zhì)，應(yīng)對(duì) HFB 高鹽環(huán)境下的滲透壓失衡。

4. 鋅離子穩(wěn)態(tài)強(qiáng)化

鋅轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控因子 ZurR（log?FC=2.9）激活 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Lmo1671（log?FC=3.4），維持鋅離子平衡，輔助超氧化物歧化酶等抗氧化酶功能，減輕氧化損傷。

功能網(wǎng)絡(luò)整合

STRING 分析顯示，ClpB（蛋白復(fù)性）、UvrA（DNA 修復(fù)）、OatA（細(xì)胞壁重構(gòu)）為核心節(jié)點(diǎn)，形成 “蛋白 - DNA - 細(xì)胞壁 - 離子穩(wěn)態(tài)” 級(jí)聯(lián)修復(fù)網(wǎng)絡(luò)，針對(duì)性抵消高溫誘導(dǎo)的多分子損傷，為脫離滯后期奠定基礎(chǔ)。該特化通路體現(xiàn) “應(yīng)激歷史 - 損傷類型 - 修復(fù)策略” 的特異性適應(yīng)機(jī)制。

3.4 代謝特征與底物利用

HPLC 分析 HFB 富集過程（0–24 h）代謝物動(dòng)態(tài)，揭示以下特征：

1. 碳水化合物利用模式

? 快速消耗：葡萄糖、甘油、蘋果酸在 10–14 h 內(nèi)耗盡（對(duì)應(yīng)指數(shù)期啟動(dòng)），纖維二糖（初始 10 g/L）24 h 僅降至 0.8 g/L，利用效率低。

? 非優(yōu)選底物：丙酮酸（2 mM）、琥珀酸（1 mM）濃度無顯著變化，未被優(yōu)先代謝。

2. 氨基酸代謝特征

HFB 含除半胱氨酸外的必需氨基酸，但僅谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸 24 h 降幅約 25%，蘇氨酸積累 40%，其余氨基酸濃度穩(wěn)定，表明氨基酸非主要能量來源。

3. 代謝途徑解析

? 厭氧主導(dǎo)：乳酸（5.5 mM）、甲酸（4 mM）積累，顯示糖酵解驅(qū)動(dòng)的混合酸發(fā)酵為主要途徑，盡管有氧培養(yǎng)，細(xì)胞色素氧化酶相關(guān)蛋白未上調(diào)。

? 應(yīng)激適應(yīng)：氧化應(yīng)激蛋白（如硫氧還蛋白）上調(diào)與代謝產(chǎn)物協(xié)同，推測通過調(diào)節(jié)胞內(nèi) pH 應(yīng)對(duì) HFB 高鹽及抗生素壓力。

與蛋白組學(xué)關(guān)聯(lián)

代謝數(shù)據(jù)印證 “能量重分配” 策略：葡萄糖等碳水化合物優(yōu)先通過糖酵解供能，滿足核糖體早期合成及熱應(yīng)激細(xì)胞修復(fù)通路的 ATP 需求；氨基酸利用有限，與轉(zhuǎn)氨酶等代謝酶無顯著差異表達(dá)一致。

結(jié)論：滯后期以 “葡萄糖依賴型混合酸發(fā)酵” 為主，能量優(yōu)先用于損傷修復(fù)而非生物量積累，解釋了低接種量時(shí)因碳源有限導(dǎo)致滯后期延長的機(jī)制。

3.5 鋅離子對(duì)滯后期的影響

基于蛋白組學(xué)中鋅穩(wěn)態(tài)蛋白（如 ZurR 調(diào)控的 Lmo1671）上調(diào)，研究評(píng)估金屬離子對(duì)富集動(dòng)力學(xué)的影響：

? 鋅的作用：10 μM Zn2?使熱應(yīng)激細(xì)胞達(dá)到 OD???=0.1 的時(shí)間（TTR）從 22.8±0.3 h 縮短至 21.8±0.6 h（p=0.03），參考細(xì)胞 TTR 從 20.7±0.5 h 微降至 20.1±0.8 h（僅熱應(yīng)激組顯著）。

? 其他金屬效應(yīng)：鈷（≥5 μM）和銅（≥10 μM）抑制生長，20 μM 鈷使熱應(yīng)激細(xì)胞 TTR 延長至 26.5±1.2 h（+16%），鎂/錳無顯著影響。

? 機(jī)制與意義：鋅未改變對(duì)數(shù)期生長速率（μ=0.85 vs 0.83 h?1），提示僅促進(jìn)滯后期復(fù)蘇。其效應(yīng)幅度（<1 h）遠(yuǎn)小于接種量差異（如 2 vs 7.5 log CFU/ml 相差 6.3 h），無實(shí)際檢測優(yōu)化價(jià)值。

綜上，鋅離子通過強(qiáng)化鋅穩(wěn)態(tài)微弱促進(jìn)熱應(yīng)激細(xì)胞復(fù)蘇（統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，生物學(xué)效應(yīng)有限），非關(guān)鍵限速因素。

3.6 spent培養(yǎng)基補(bǔ)充對(duì)滯后期的影響

基于蛋白組學(xué)中復(fù)蘇促進(jìn)因子（RPF，如 Lmo2522）的高表達(dá)，研究測試了含 RPF 的spent HFB（富集培養(yǎng)后的無菌上清液）對(duì)滯后期的影響：

? 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將新鮮 HFB 與spent HFB 按 10%、25% 混合，接種低濃度參考細(xì)胞（2 log CFU/ml）和熱應(yīng)激細(xì)胞（2.5 log CFU/ml），利用全自動(dòng)生長曲線分析儀（Bioscreen C）監(jiān)測 OD???變化，通過 Baranyi 模型擬合生長動(dòng)力學(xué)。

? 關(guān)鍵結(jié)果：

熱應(yīng)激細(xì)胞：25% spent HFB 使滯后期從 9.4±0.1 h 縮短至 8.2±0.5 h（p=0.04），但置信區(qū)間重疊，最終濃度與新鮮 HFB 一致（7.5 log CFU/ml）。

? 參考細(xì)胞：10%/25% spent HFB 未改變其短滯后期（2.3 h vs 對(duì)照 2.4 h，p>0.05）。

極限模擬：極低菌量（1 cell/250 ml）富集時(shí)，spent HFB 僅將達(dá) 2 log CFU/ml 時(shí)間從 30.5 h 微降至 29.5 h（無生物學(xué)意義）。

? 機(jī)制與結(jié)論：spent HFB 中 RPF 可能通過降解細(xì)胞壁碎片促進(jìn)復(fù)蘇，但 HFB 營養(yǎng)充足（100% 廢 HFB 仍支持相同生長），補(bǔ)充策略因效應(yīng)微弱（<1.5 h 縮短）和操作復(fù)雜，無實(shí)際優(yōu)化價(jià)值。

綜上，本研究通過蛋白組學(xué)與功能驗(yàn)證結(jié)合，揭示復(fù)蘇促進(jìn)因子的胞外作用在應(yīng)激細(xì)胞適應(yīng)中具有潛在功能，但其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值受限于富集體系的營養(yǎng)平衡及應(yīng)激損傷程度。

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總結(jié)

本研究揭示單核細(xì)胞增生李斯特菌滯后期的適應(yīng)性響應(yīng)機(jī)制，添加鋅離子和補(bǔ)充spent HFB 對(duì)滯后期影響微弱?？s短應(yīng)激損傷細(xì)胞滯后期對(duì)降低假陰性結(jié)果重要，HFB 富集體系優(yōu)化應(yīng)聚焦其他策略以實(shí)現(xiàn)受損細(xì)胞高效復(fù)蘇，為提升檢測方法靈敏度和可靠性提供新路徑。

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