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培養(yǎng)基里加了TTC，培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)菌還能進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢嗎？

發(fā)布時(shí)間：

2025-07-17

2,3,5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）作為四唑鹽（tetrazolium salts, TTZ）家族的重要成員，自 1894 年首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，便在微生物學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值與研究潛力。值得關(guān)注的是，在 2021 年 4 月的一次專業(yè)交流群討論中，王老師分享了一位網(wǎng)友提出的相關(guān)求助問(wèn)題，群內(nèi)陳老師針對(duì)問(wèn)題作出了專業(yè)解答。今天，我們一同重溫TTC 的核心知識(shí)。

一

原理解析：TTC 顯色與革蘭氏染色是否沖突？

1. TTC 的顯色原理

TTC（2,3,5 - 氯化三苯基四氮唑）是一種無(wú)色水溶性化合物，其顯色依賴微生物的代謝活性：

活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可將 TTC 還原為紅色、水不溶性的三苯基甲臜（TPF），TPF 會(huì)沉積在細(xì)胞內(nèi)或周圍，使細(xì)菌菌落或細(xì)胞呈現(xiàn)紅色；而死菌或代謝停滯的細(xì)胞無(wú)法完成這一還原反應(yīng)，始終保持無(wú)色。這一過(guò)程本質(zhì)是對(duì)微生物代謝能力的指示。

2. 革蘭氏染色的原理

革蘭氏染色的區(qū)分依據(jù)是細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異：

? 革蘭氏陽(yáng)性菌（G?）：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)層次多且交聯(lián)致密。經(jīng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖網(wǎng)因失水縮小，能牢牢鎖住結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，染色后呈紫色。

? 革蘭氏陰性菌（G?）：細(xì)胞壁薄，外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差。乙醇脫色時(shí)，類脂外膜迅速溶解，肽聚糖網(wǎng)無(wú)法阻擋結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出，脫色后呈無(wú)色，經(jīng)紅色復(fù)染劑處理后最終呈紅色。

結(jié)論

革蘭氏染色基于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異，TTC 顯色則依賴細(xì)菌體內(nèi)脫氫酶與 TTC 的反應(yīng)，二者機(jī)制完全不同，通常不會(huì)相互干擾。因此，培養(yǎng)基中添加 TTC 后培養(yǎng)出的細(xì)菌，可進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

二

TTC 的選擇性抑制作用

TTC 對(duì)不同類型微生物的生長(zhǎng)抑制效果存在顯著差異，主要體現(xiàn)在對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的選擇性作用上。

1. 對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制

大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、普通變形桿菌、宋內(nèi)志賀氏菌等革蘭氏陰性菌對(duì) TTC 抗性較強(qiáng)。即使 TTC 濃度達(dá)到 500μg/ml（摩爾濃度 10?2），仍未表現(xiàn)出抑制效果。

2. 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制

革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì) TTC 的敏感性差異較大：

? 0.05% 濃度的 TTC 可完全抑制多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、抗酸菌和放線菌的生長(zhǎng)；

? 金黃色葡萄球菌抗性較強(qiáng)，在 500μg/ml 濃度下仍能生長(zhǎng)；

? 化膿性鏈球菌和枯草芽孢桿菌對(duì) TTC 較敏感，在32μg/ml濃度下不生長(zhǎng)，表明 TTC 對(duì)這兩種菌有一定抑制作用。

3. 濃度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

? 當(dāng)培養(yǎng)基中 TTC 濃度不超過(guò) 0.001% 時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性菌、抗酸菌和放線菌可正常生長(zhǎng)，且菌落能達(dá)到最大著色度；

? 濃度低至 0.0001% 時(shí)，所有受試微生物的菌落中均無(wú)法觀察到還原產(chǎn)物的顏色；

? 隨著濃度從 0.05% 升至 1.0%，會(huì)依次抑制根瘤菌科、無(wú)色桿菌科、腸桿菌科及假單胞菌科成員的生長(zhǎng)；

? 霉菌可耐受高達(dá) 0.25% 的濃度，但在所有濃度下，其菌落中還原態(tài) TTC 的含量都極少。

三

TTC的主要應(yīng)用

1. 微生物檢測(cè)

可用于食品、化妝品、環(huán)境等樣本的菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，還能抑制菌落蔓延，是食品微生物分析中干燥可復(fù)水膜系統(tǒng)（測(cè)試片）的關(guān)鍵成分。

2. 微生物的選擇性分離與鑒定

?選擇性培養(yǎng)：利用 TTC 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的抑制差異，在培養(yǎng)基中添加特定濃度的 TTC（如 0.01%-0.05%），可選擇性分離革蘭氏陰性菌（如腸桿菌科、假單胞菌科），或抑制雜菌以富集目標(biāo)菌。

? 初步鑒別微生物種類：不同微生物還原 TTC 的能力不同，可通過(guò)顯色強(qiáng)度和速度輔助鑒別。例如，鏈球菌屬中，乳鏈球菌還原能力強(qiáng)，菌落呈深紅色，而乳酪鏈球菌還原能力弱，菌落顏色較淺；酵母菌中，白假絲酵母可形成粉紅色菌落，其他酵母可能為白色，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)初步區(qū)分。

3. 微生物代謝動(dòng)力學(xué)分析

? 定量評(píng)估代謝活性：液體培養(yǎng)基中，TTC 還原生成的 TPF 量與活菌數(shù)量及代謝強(qiáng)度正相關(guān)。通過(guò)比色法（如在 630nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度）可量化 TPF 的生成速率，反映微生物的代謝動(dòng)力學(xué)特征。

? 生物膜間接定量檢測(cè)：生物膜內(nèi)活細(xì)胞釋放的 TPF 可通過(guò)比色法檢測(cè)，進(jìn)而評(píng)估生物膜的清除率。

4. 跨領(lǐng)域應(yīng)用

? 農(nóng)業(yè)與植物領(lǐng)域：可用于驗(yàn)證種子的發(fā)芽能力。

? 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：可對(duì)正?；罱M織、梗死或缺血組織進(jìn)行染色。

四

TTC 使用的注意事項(xiàng)

1.避光要求：TTC 對(duì)光敏感，需避光儲(chǔ)存和培養(yǎng)；培養(yǎng)基配制后應(yīng)盡快使用，避免自然光導(dǎo)致的非酶促分解。

2.滅菌方式：TTC 溶液需經(jīng) 0.22μm 膜過(guò)濾滅菌，避免高壓滅菌（高溫會(huì)使 TTC 自行還原為 TPF）。

3.溶液新鮮度：TTC 溶液建議現(xiàn)用現(xiàn)配，以防氧化失效。若使用低濃度（如 0.05%），可在 4-8℃儲(chǔ)存并重復(fù)使用，但需提前驗(yàn)證其活性。

4.濃度控制：若需使所有細(xì)菌菌落更易觀察，TTC 最終濃度不應(yīng)超過(guò) 0.001%；若僅需獲取革蘭氏陰性桿菌的菌落，可安全使用 0.01%-0.05% 的濃度。

5.純度要求：為保證指示效果（顯色清晰、結(jié)果可靠、重復(fù)性好），建議使用高純度 TTC。

2025-08-08